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牛病毒性腹泻病毒研究进展


日期:2009-12-5 15:39:55 点击次数 5033 发布单位:爱养殖信息网  录入:www.iyangzhi.com

 牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)的病原,自20世纪中期Olafson等在美国描述并鉴定至今研究已近60年。目前,该病毒在世界范围内广泛分布,是造成全球乳/肉牛业经济损失的主要病原。20世纪80年代我国也发现此病毒的存在。2008年发布的中华人民共和国农业部公告第96号将牛病毒性腹泻定为三类疫病,世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病及国际动物胚胎交流病原名录三类疫病。BVDV是黄病毒科瘟病毒属的代表种,为有囊膜的单股正链RNA病毒。BVDV仅有一种血清型,毒株之间存在抗原多样性。根据接种上皮细胞培养物是否引起细胞病变,可将BVDV分为两种生物型(biotype),即致细胞病变型(cytopathic biotype,cp)和非致细胞病变型(noncytopathic biotype,ncp)。根据BVDV基因组5′-NTR区差异可将其分为两个基因型(gentype),即BVDV-1和BVDV-2。日本学者根据BVDV基因组E2区编码序列将其分为8个基因亚型(1a、1b、1c、ld、le、1f、So、2a)。Giangasper M 等根据BVDV-2型5′-NTR二级结构差异将BVDV-2划分为BVDV-2a、BVDV-2b、BVDV-2c和BVDV-2d 4个亚型。由于RNA病毒的高突变性以及国际交流的日渐频繁,一定地区的BVDV基因新亚型还在不断出现。因此,BVDV基因亚型的研究对流行病学研究颇有裨益。

    BVDV感染情况复杂,持续性感染个体症状隐蔽,且BVDV感染90%的情况下并不引起注意。但是BVDV分布广,在北美地区发现以来,散布美国和日本,然后是欧洲、南非及新西兰;动物带毒率高,特别是BVDV严重影响牛的生殖,使之成为造成全球养牛业经济损失的重要疫病。因此,防控BVDV是十分必要的,并且是经济可行的。此外,BVD具有独特的分类地位、典型单股正链RNA病毒生物学特性,对其研究具有重要的意义,现就BVDV分子生物学研究现状阐述如下。
1  病毒粒子结构组成及功能
    BVDV基因组是一条长约12.3kb的正链RNA,由一个含有约3900个密码子的开放读码框(ORF)和两侧的5′及3′端非编码区组成(某些cpBVDV基因组存在插入或重复的现象,基因组长度可达12.5kh)。ORF编码一个多聚蛋白,并在宿主和病毒蛋白酶的作用下切割为多个成熟的病毒蛋白质。按照这些蛋白在基因组上的编码顺序依次命名为Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。非编码区对RNA的转译起始和稳定性具有重要意义,5′末端存在内部核糖体进入位点(IRES),可指导多聚蛋白的合成;位于3′末端非编码区的3V基序是一个由协同活性序列及结构元件组成的复杂的RNA基序,它对病毒RNA复制、转译、正确终止都具有重要作用,同时也是宿主细胞因子NFAR的结合位点。
    核心蛋白(C)和包膜糖蛋白(Erns、El、E2)是结构蛋白,它们与基因组RNA和脂膜共同形成病毒粒子。不含Erns的改造病毒粒子依然能够侵染宿主细胞,因此Erns蛋白不是病毒侵入所必需的。而BVDV侵染细胞必需依赖E1-E2异聚体的存在,且两个蛋白的跨膜区中带电氨基酸在异二聚体形成过程中起到至关重要的作用。E2蛋白是BVDV病毒粒子的主要中和抗原,在毒株间氨基酸序列差异较大。C蛋白缺乏二级结构,是一种无序的小型强碱性多肽。借助其强碱性,C蛋白能够结合病毒RNA,但亲和能力低且几乎没有特异性。研究发现它能够功能性的取代非特异性的无关蛋白与病毒RNA的结合,推测在RNA包装和病毒粒子形成中具有一定功能。
2  病毒复制周期及蛋白裂解过程
    首先,糖蛋白Erns与细胞表面黏多糖的结合引起病毒与细胞的黏附,随即引发特异性的结合。研究证明CD46(CD46bov)是BVDV的细胞受体。病毒糖蛋白E1-E2异聚体以及宿主细胞表面受体CD46介导病毒粒子与宿主细胞的特异性结合。随后经宿主细胞网格蛋白介导的内吞作用进入细胞内部,此过程可被氯喹、氯丙嗪以及过量表达无功能的EPSl5蛋白所抑制。有研究者认为,低密度脂蛋白(LDL)受体为BVDV侵入细胞的受体,此观点被Krey T等的研究所否定。
    病毒基因组RNA释放后,由位于5′末端的内部核糖体进入位点(IRES)指导多聚蛋白的合成。初生蛋白通过核心蛋白C末端的信号序列定位在内质网上,这个多聚蛋白在细胞及病毒的蛋白酶的作用下切割成单个病毒蛋白,切割可以发生在转译过程中,也可以发生在转译完成后。多聚蛋白的加工调控过程是正链RNA病毒复制周期中的关键步骤。Npro。蛋白的自我剪切是多聚蛋白的第一次切割,切点为位于Npro/C连接处的半胱氨酸/丝氨酸。C/Erns、E1/E2、和E2/p7切点可能是由宿主信号肽酶切割的。核心蛋白C经过宿主酶两次酶切释放成熟的核心蛋白。目前还没有确认感染性病毒粒子的产生是否必须有非结构蛋白p7和NS2的参与,后者只在NS2-3前体时具有功能。NS2和NS3都具有蛋白酶活性。NS2可以对自身C端NS2/3处进行单酶切。丝氨酸蛋白酶NS3能够多次切割病毒多聚蛋白,是病毒复制必须的。研究表明,BVDV(NADL株)的NS3蛋白酶对非结构蛋白间切割位点NS3/4A、4A/4B、4B/5A和5A/5B进行切割加工。通过氨基端测序分析裂解位点附近序列,四个切点左侧为一个保守的亮氨酸,右侧为一个保守的丝氨酸(3/4A、4B/5A、5A/5B切点)或者丙氨酸(4A/4B切点)。在切割4B/5A及5A/5B位点时,NS3蛋白酶需要64氨基酸残基的NS4A作为其辅助因子。NS3蛋白具有的多种其他催化活性也在病毒复制周期中发挥了关键性的作用,特别是它的腺苷三磷酸酶/RNA螺旋酶活性。研究认为,NS3蛋白的C末端可能是RNA复制过程中十分重要的功能结构域。NS5B是一种RNA依赖的RNA聚合酶。核心蛋白与新合成的病毒基因组RNA组成的核糖核蛋白体在内质网结合具有病毒结构蛋白的脂膜,组装成成熟的病毒粒子。病毒粒子穿过ER内腔,经细胞分泌途径到细胞外部。
3  细胞损伤及免疫逃逸机制
    BVDV分为cp型BVDV和ncp型BVDV两种生物型。体外培养的两种生物型BVDV感染细胞中均表达NS2-3,此蛋白是产生感染性病毒粒子所必须的,而NS3蛋白的产生与其cp表型密切相关。通常NS3的产生需归因于cp型BVDV基因组的特异性突变(插入、重复及缺失),且突变的发生往往与RNA重组有关。研究发现,cp型BVDV  Oregon毒株病毒不具有上述突变,能够通过加工NS2-3产生NS3:NS3蛋白酶不参与的情况下,多聚蛋白在1589和1590位残基之间发生裂解。研究发现,切割信号定位在NS2上,NS2末端在此NS2-3剪切中发挥了至关重要的作用。另外,NS3蛋白存在于ncp型BVDV感染个体的淋巴组织、脑、甲状腺、肺、肾中,证明ncp型BVDV的NS2-3也能够在体内裂解。cp型BVDV可直接引起感染细胞的凋亡,也可通过间接途径引起未感染细胞的凋亡。cp型BVDV的复制导致dsRNA的积累,引发双链RNA诱导的细胞凋亡途径。cp型BVDV还可通过激活内质网类似激酶PERK(PKR-like ER kinase),诱发内质网应激信号途径诱导的细胞凋亡过程,此细胞凋亡过程的起始与抗凋亡蛋白Bcl-2的下调、诱导表达caspase 12以及谷胱甘肽水平下降有关。感染cp型BVDV的巨噬细胞受到脂多糖刺激时可释放因子导致巨噬细胞发生活化诱导的细胞凋亡,感染ncp型BVDV的巨噬细胞则没有此特征。之前认为此现象与IFN-l有关,但是两种生物型BVDV病毒的细胞培养上清液都具有启动未感染巨噬细胞活化诱导凋亡的活性,且IFN被牛痘病毒编码的IFN-l受体中和后,不影响上清启动凋亡的能力。有研究检测到一种分子质量在30 ku~l00ku的启动凋亡的因子,推断细胞损伤不仅仅是由病毒复制引起的。Ridpath J F等通过建立牛淋巴样细胞系作为体外研究模型,并根据接种到淋巴样细胞和上皮细胞后的培养特征将BVDV分为3个生物型,即非致细胞病变型、致淋巴细胞病变型和致细胞病变型。因此,BVDV是否具有致细胞病变能力不单单取决于毒株自身,也与宿主细胞种类和所处生长环境有关。针对BVDV细胞损伤效应以及生物型转换方面的研究必须考虑到宿主细胞的因素。Lackner T等报道,宿主细胞的一种名为Jiv (J-domain protein inter acting with viral protein)的伴侣蛋白与病毒蛋白NS2之间的相互作用在ncp型BVDV建立持续性感染过程中发挥重要的作用,Jiv的含量能够影响病毒RNA复制总量上限,抑制病毒RNA的表达,避免病毒复制导致的细胞凋亡,从而建立持续性感染。笔者认为,目前针对BVDV的生物型划分概念应当更加严格的加以限定,它虽然一定程度上反映了BVDV与宿主细胞,特别与上皮细胞之间的关系,但不能明显的对BVDV的分子生物学特征做出界定:ncp型BVDV强毒株急性感染导致血液中白细胞减少及坏死、凋亡的白细胞增多,推断ncp型BVDV针对循环白细胞具有类似cp型BVDV的细胞损伤效应。
    Npro和Erns在阻断INF诱导途径、建立持续宫内感染方面具有重要作用。若两者均发生突变,则造成高剂量的INF分泌,造成建立宫内持续性感染的失败。Erns可干扰dsRNA诱导的IFN-α/β合成途径,试验证明,位于宿主细胞表面的具有酶活性的Erns能够阻断dsRNA诱导的IFN合成,表达Erns的细胞合成IFN的能力受到限制,感染BVDV表达Erns。但缺少N 端蛋白酶Npro者同样如此。持续性感染动物血液中存在的Erns游离蛋白大约为50 ng/mL,此剂量足以产生上述效应。Npro通过转译时的自我水解加工产生核心蛋白N末端和自身C端,它是瘟病毒所独有的蛋白,目前的研究发现它是IFN的颉颃物,能够调控INF-1的产生。这个调节作用是通过将干扰素调节因子-3(IRF-3)连接多聚泛素,并由蛋白酶体依赖的降解途径加以降解。有研究报道,Npro蛋白N 端对其抑制干扰素合成发挥至关重要的作用。因此Npro在BVDV逃避宿主免疫反应过程中起到重要,缺失此蛋白的改造BVDV产生感染性病毒粒子的能力大大下降。这两个蛋白与病毒持续感染及病毒生存有关。
   BVDV感染影响牛单核细胞中专职抗原递呈相关蛋白的表达,可启动单核细胞激活和分化,抑制其将抗原递呈给T细胞。对污染有ncp BVDV的动脉内皮细胞(bovine aortic endothelial cells,BAECs)进行基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE),检测表明P选择素、色氨酸tRNA合成酶及前列腺素D2合成酶的表达,以及对LPS和dsRNA的反应能力均有显著变化。由于BAECs常用于研究内皮细胞功能,BVDV污染可能严重影响研究结果。BVDV改变蛋白激酶及相关蛋白的表达,影响感染的进程及牛单核细胞抗病毒机制。使用蛋白组学方法发现BVDV感染的牛单核细胞中18种与细胞分化、诱导迁移能力、抗病毒机制(干扰素/凋亡)、生物合成糖代谢和癌变相关蛋白的表达发生了显著的变化。在感染ncp/cp型BVDV的单核细胞中有六种与细胞迁移性、抗病毒机制及糖代谢和抗肿瘤相关的蛋白的表达有差别,特别是RACK(receptor of aactivated C kinase)、PK(pyridoxal kinase)、DGK(biacyglycerol kinase)以及BTK(brutons tyrosine kinase),此4种蛋白的表达量在感染cp型BVDV的单核细胞中较之ncpBVDV感染细胞中的表达量更低,这可能与细胞损伤效应有关。BVDV还调控牛外周血单核细胞中TLR(toll-like receptors)、细胞因子和供刺激因子的表达。检测发现ncp/cp型BVDV感染的牛单核细胞中TLR、IFN-I、促炎症因子和Thl/Th2细胞因子基因表达大体具有相同的特征。但两者也有显著的不同点,ncp型BVDV感染后1h TLR3表达显著提高,与之相关的IFN-I和IL-12表达也显著提高,cp型BVDV感染不具有此种现象。两种生物型的BVDV感染后24hTLR7表达都占优势,存在促炎症因子TNF-α、IL-lβ、IL-6、共刺激因子CD80和CD86的表达抑制,但不改变Thl型细胞因子IL-12和INF-γ的表达。BVDV可能通过改变TLR3/7的表达及其信号通路来逃避免疫反应。此外,在cp型BVDV-2感染的细胞中存在原癌基因(c-fos、c-jun、junB、junD)mRNA的合成增加,但是相应的蛋白质却不增加,这导致其mRNA的积累。
    无论造成细胞损伤与否,或是通过免疫逃逸机制建立持续性感染,都是病毒与细胞相互作用的结果。要对其有进一步的全面了解,必须将两者紧密地联系在一起加以考察,即研究病毒蛋白功能的同时考虑宿主细胞特性、研究宿主细胞表达谱系的同时要对病毒特性加以描述。
4  结语
    反向遗传操作系统在正链RNA病毒研究中应用十分成熟,获得了不少有价值的研究成果。当今生命科学新领域蛋白组学发展又给病毒研究提供了新思路新方法。BVDV因其经济影响和特殊研究价值受到研究人员的广泛关注。目前在BVDV分子生物学,特别是基因组结构及功能、基因分型及流行病学研究、以NS3、Npro蛋白功能为代表的病毒蛋白质功能研究、以E2蛋白为代表的疫苗研究以及BVDV影响宿主细胞基因表达谱系变化都得到了大量有益的结果。BVDV生物型及细胞损伤效应、免疫逃逸机制方面,利用反向遗传技术以及蛋白组学方法相结合的手段,从病毒与宿主(细胞)之间相互作用的角度理解上述问题,是今后一段时间研究人员须努力的方向之一。

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